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ISO/TS 26844:2006 — 乳及乳制品：管扩散法测定抗菌药物残留
ISO/TS 26844:2006（IDF/RM 215）使用嗜热脂肪芽孢杆菌双管扩散法检测乳品中抗菌药物残留的技术规范
ISO/TS 26844:2006 标准概述
ISO/TS 26844:2006（IDF/RM 215:2006）规定了用于检测乳及乳制品中多种抗菌物质的微生物抑制试验方法。该技术规范由ISO和国际乳品联合会（IDF）联合发布，采用以嗜热脂肪芽孢杆菌ATCC 10149为测试菌株的双管扩散法，适用于原料乳、热处理乳和复原乳粉。
该方法是乳品质量控制中重要的筛查工具，能够检测β-内酰胺类、四环素类、大环内酯类、氨基糖苷类、磺胺类和甲氧苄啶残留，检测浓度与法规合规要求相关。
该方法基于pH指示剂颜色变化原理：嗜热脂肪芽孢杆菌正常生长导致琼脂中的溴甲酚紫指示剂由紫色变为黄色。当存在抗菌物质时，生长受到抑制，培养基保持紫色。
双管测试系统
双管设计提供了互补的检测能力。A管在pH 7.0条件下以氯霉素作为增效剂，对四环素类残留具有更高的灵敏度。B管在pH 8.0条件下使用甲氧苄啶，针对β-内酰胺类、大环内酯类、氨基糖苷类、磺胺类和甲氧苄啶残留。
| 抗菌药物类别 | A管 (pH 7.0, 含氯霉素) | B管 (pH 8.0, 含甲氧苄啶) |
|---|---|---|
| β-内酰胺类（苄青霉素） | 2 ug/kg | 3 ug/kg |
| 大环内酯类（红霉素） | — | 10 ug/kg |
| 氨基糖苷类（新霉素） | — | 30 ug/kg |
| 四环素类（土霉素） | 100 ug/kg | 400 ug/kg |
| 磺胺类（磺胺嘧啶） | — | 150 ug/kg |
所示检测限来自涉及三家经验丰富的荷兰实验室的协作研究。实际性能可能因乳品基质、测试菌株批次和实验室条件而异。
操作流程与结果判读
测试程序遵循严格标准化的操作流程。乳样首先在80 C下热处理10分钟，以灭活热不稳定性天然抑制物质。冷却后，将0.3 ml样品分别移取到A管和B管中。试管在室温下放置1小时以促进扩散，然后倒掉牛奶层并盖好试管以防止蒸发。
可选择进行热休克处理（70 C 10分钟）以激活芽孢。在63 C下培养4小时15分钟（正负30分钟），直至阴性对照管刚好从紫色完全变为黄色。测试样品中固体培养基呈现完全或部分紫色表示阳性结果——即存在抑制物质。
每批测试必须包括六个对照管：A管含苄青霉素对照、土霉素对照和阴性乳；B管含苄青霉素对照、磺胺嘧啶对照和阴性乳。如果对照未能显示预期的颜色变化，则该批测试必须重做。
确认实验与质量保证
阳性结果可通过推定性测试进行确认。β-内酰胺类残留使用β-内酰胺酶确认——如果酶处理能够抵消抑制活性，则存在β-内酰胺类药物。磺胺类使用对氨基苯甲酸（PABA）确认，因为PABA可以逆转磺胺类的抑制作用。对于其他抑制剂，需要按照ISO 18330/IDF 188采用更精密的方法，如微生物多平板测试、免疫测定或色谱方法（HPLC、LC-MS）。
测试菌株悬浮液的质量控制至关重要。每批新的菌悬液必须用五种标准溶液进行验证：苄青霉素（2 ug/kg）、磺胺嘧啶（150 ug/kg）、新霉素（30 ug/kg）、红霉素（10 ug/kg）和土霉素（100 ug/kg）。测试菌悬液的浓度应约为每毫升500万个菌落形成单位，可在-20 C以下储存最长一年。
标准强调，测试样品中的抗生素组合可能给推定性确认带来困难。当存在多种抗生素类别时，单一确认试剂可能无法完全逆转其抑制效应，需要进行全面分析。
常见问题解答
问1：该方法可检测的抗菌物质范围是什么？
管扩散法可检测多种抗菌物质，包括β-内酰胺类、四环素类、大环内酯类、氨基糖苷类、磺胺类和甲氧苄啶。但该方法为筛查测试——阳性结果需要确认分析以进行确定性鉴定。
管扩散法可检测多种抗菌物质，包括β-内酰胺类、四环素类、大环内酯类、氨基糖苷类、磺胺类和甲氧苄啶。但该方法为筛查测试——阳性结果需要确认分析以进行确定性鉴定。
问2：整个测试需要多长时间？
包括样品制备、扩散、可选热休克、培养和结果判读在内的完整流程约需6-7小时。
包括样品制备、扩散、可选热休克、培养和结果判读在内的完整流程约需6-7小时。
问3：该方法适用于发酵乳制品吗？
适用范围规定为原料乳、热处理乳和复原乳粉。发酵产品因其天然酸性和细菌含量可能需要方法改进。
适用范围规定为原料乳、热处理乳和复原乳粉。发酵产品因其天然酸性和细菌含量可能需要方法改进。
问4：阳性结果如何报告？
结果简单地以抗菌物质存在或不存在来表示。进一步定性需要按照ISO 18330/IDF 188或其他验证方法进行额外测试。
结果简单地以抗菌物质存在或不存在来表示。进一步定性需要按照ISO 18330/IDF 188或其他验证方法进行额外测试。
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