ISO 27105:2009 — 牛奶和奶酪 — 高效液相色谱法测定溶菌酶

1. 乳制品中溶菌酶测定的范围与原理

ISO 27105:2016 规定了使用高效液相色谱法（HPLC）测定牛奶和奶酪中鸡蛋清溶菌酶含量的方法。溶菌酶又称胞壁质酶，是一种天然抗菌酶，广泛用作乳制品工业的防腐剂，特别是在奶酪生产中防止由酪丁酸梭菌孢子引起的晚期产气缺陷。该方法由 ISO 和国际乳品联合会（IDF）联合制定，发布为双编号标准 ISO 27105|IDF 216，代表了国际共识。

溶菌酶被公认为安全（GRAS），在许多奶酪品种中优于化学防腐剂，特别是有机和天然产品类别。其在乳制品中的浓度通常为牛奶中 5 至 50 mg/L 到奶酪中 100 至 500 mg/kg，取决于添加量和奶酪类型。准确定量对法规合规和质量控制都至关重要——溶菌酶不足可能导致晚期产气缺陷，而过量则不必要地增加生产成本。HPLC 方法提供了区分完整溶菌酶与加工或陈化中可能产生的降解或变性形式所需的特异性。

2. 样品制备与色谱程序

牛奶和奶酪基质的样品制备因成分不同而有所区别。牛奶样品用水稀释并通过 0.45 微米滤膜过滤后直接进样——由于牛奶的液体性质和相对简单的基质，程序直接。奶酪样品需要更广泛的制备：将奶酪磨碎或均质化，用含氯化钠和磷酸盐的特定缓冲溶液在定义 pH 下提取，然后离心和过滤以去除脂肪和不溶性蛋白质。提取效率关键取决于缓冲液组成、pH、温度和提取时间，应使用加标样品进行验证。

色谱分离使用反相 HPLC，C18 色谱柱和含 0.1% 三氟乙酸作为离子对试剂的乙腈和水梯度。溶菌酶在 220 nm 下通过紫外吸光度检测，该方法对蛋白质中的肽键和芳香族氨基酸具有良好的灵敏度。根据预期浓度范围使用单点或多点校准，使用已知纯度的纯化溶菌酶标准品进行校准。该标准报告了实验室间测试的精密度数据，重复性相对标准偏差为 2% 至 6%，再现性相对标准偏差为 5% 至 12%，取决于浓度和基质类型。

色谱条件必须优化以实现溶菌酶与基质成分的基线分离。牛奶蛋白或奶酪降解产物的共洗脱峰可能干扰定量。该标准包含使用 LC-MS/MS 的验证程序（附件 A），用于在获得不确定结果时进行确认分析——这对加工奶酪或热处理乳制品特别有价值。系统适用性标准包括保留时间稳定性在 2% 以内、峰不对称因子在 0.8 至 1.5 之间以及与最近峰的分离度至少为 1.5。

3. 乳品质量控制实验室的工程见解

准确的溶菌酶定量对法规合规和过程控制都至关重要。在奶酪生产中，溶菌酶不足允许酪丁酸梭菌孢子萌发产气，导致晚期产气缺陷，表现为不希望的质地变化、异味甚至加工奶酪产品中的罐膨胀。过量溶菌酶则不必要地增加生产成本——在每升牛奶 5 至 25 mg 的典型使用水平下，即使是少量过量也会显著影响大规模操作的盈利能力。HPLC 方法提供了仅测量活性溶菌酶蛋白的特异性，不同于一些微生物学方法可能因存在的其他抗菌化合物而高估。

方法性能在很大程度上取决于适当的色谱柱维护和流动相制备。C18 色谱柱容易受到梯度条件下可能不洗脱的疏水性牛奶蛋白和肽的污染。定期用强溶剂清洗色谱柱和定期更换保护柱是必要的维护实践。实验室应建立系统适用性标准，包括保留时间稳定性、峰对称性和与相邻峰的分离度。建议定期分析质量控制样品以监测方法随时间的性能。

该标准的实验室间精密度数据为实验室性能评估提供了基准。实验室应通过方法验证和持续质量控制建立自己的精密度参数，并将其性能与公布的 RSDr 和 RSDR 值进行比较。如果实验室的精密度显著差于公布值，则表明样品制备、色谱或校准存在问题需要调查。该方法适用于其范围内的牛奶和奶酪——对其他乳制品如酸奶、奶油或乳清产品的适用性应通过方法验证确认。

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