ISO 26323:2009 — 乳制品发酵剂酸化活性的连续pH测定方法（CpH）

1. 引言与范围

ISO 26323:2009（联合国际乳品联合会IDF发布，编号IDF 213:2009）规定了通过连续pH测量（Continuous pH measurement，简称CpH）测定乳制品发酵剂中乳酸菌酸化活性的标准化方法。该方法适用于酸奶、奶酪及其他发酵乳制品生产中使用的各类乳品发酵剂。

为什么选择连续pH测量？传统的终点pH测量只能捕获固定培养时间后的最终酸度。连续pH测量则能揭示完整的酸化动力学曲线——包括延迟期、指数产酸期和接近最终pH的平台期——为评估发酵剂性能和一致性提供远为丰富的信息。

标准规定了两种标准化乳基质：煮沸乳（B-milk 9.5，干物质含量9.5%）和高压灭菌乳（A-milk 9.5，干物质含量9.5%）。B-milk 9.5可能保留残留酶活性，可能影响某些特定发酵剂的检测结果。在这种情况下，应使用所有酶均已完全灭活的A-milk 9.5。

该方法适用于冷冻和冻干两种商业发酵剂形态，具有广泛的适用性。标准定义了关键酸化参数，包括t_a（初始pH下降时间）、pH_t（指定时间后的pH值）和t_{pH x}（达到目标pH的时间）。

2. 原理与关键参数

将指定量的发酵剂稀释并接种到标准化乳基质中，在恒定温度（30 °C、37 °C、40 °C或43 °C，取决于发酵剂类型）下培养。通过pH电极和数据采集系统连续监测酸化活性。从发酵曲线中可提取以下参数：

参数	符号	说明	典型用途
初始pH	pH_15min	接种后15分钟测量的pH值，确保电极和乳样达到平衡	基线质量检查
酸化时间	t_a	从pH_15min下降0.08 pH单位所需的时间（分钟）	延迟期活性指标
特定时间pH	pH_t	指定时间的pH值（如pH_4h、pH_6h、pH_12h、pH_16h）	中后期发酵活性
目标pH时间	t_{pH x}	达到指定pH（如pH 4.50）所需的时间	发酵终点工艺控制

工程洞察：t_a参数对发酵剂接种时的生理状态特别敏感。对于中温发酵剂，t_a过度延长（>120分钟）可能指示解冻温度不当导致的冷休克、噬菌体污染或乳基质中残留抗生素。同时监测t_a和pH_6h是排查发酵剂性能问题的有效诊断组合。

3. 试剂与设备

3.1 标准化乳基质

乳基质质量对结果的重复性至关重要。标准规定使用中热、低脂、喷雾干燥乳粉，其成分要求如下：

成分	质量分数（%）
乳蛋白	34–38
乳糖	48–56
乳脂	< 1.25
灰分	7–9
水分	< 4
可滴定酸度（以乳酸计）	< 0.15

QC-Milk 9.5的干物质含量为9.5% ± 0.2%，使用10.9–11.2 kg乳粉配制100.0 kg乳液。该干物质水平与市售杀菌瓶装乳相似，提供一致且可重复的发酵环境。

3.2 主要设备

分析天平 — 精度0.01 g和1 mg
高压灭菌器 — 能运行于99 °C ± 1 °C（B-milk）和115 °C ± 1 °C（A-milk）
恒温水浴锅 — 能维持30.0 °C、37.0 °C、40.0 °C和43.0 °C ± 0.2 °C
pH电极 — 适用于连续浸入测量，如Mettler Toledo 405-DPAS-SC-K8S/150或同等产品
圆柱形瓶 — 容量250 ml，高度16.5 cm，内径5.5 cm
温度探头 — 校准精度± 0.1 °C
数据记录器 — 配备pH和温度通道，连接数据采集软件

电极维护的关键提示：标准对pH电极的清洁和校准给予了大量关注。每次运行之间，必须冲洗电极、用乙醇去除脂肪残留、在胃蛋白酶/HCl电极清洁液中浸泡至少15分钟，并在3 mol/L KCl溶液中稳定30分钟。忽视电极维护是CpH测量重复性差的最常见原因。校准斜率必须≥93%，截距介于−30 mV和+30 mV之间。

4. 冷冻与冻干发酵剂的操作流程

4.1 冷冻发酵剂

冷冻发酵剂的样品（单组分产品10 g ± 4 g）在21 °C水浴中解冻至刚好融化（< 20分钟），确保温度不超过5 °C。接种采用两步称量法：

第一次称量（m_I1）：将1.5–2.5 g解冻发酵剂称入稀释乳瓶中
第二次称量（m_I2）：混合后，将0.8–2.9 g（取决于目标接种百分比）转入预热好的活性乳瓶中

接种百分比w_I计算公式为：w_I = (m_I1/m₁) × (m_I2/m₂) × 100，其中m₁和m₂分别为各称量步骤的总质量。

4.2 冻干发酵剂

冻干发酵剂在开封前需在室温下适应15分钟。采用三步称量法，目标接种量根据制造商推荐剂量计算。第三次称量（m_I3）使用移液管转入预热活性乳瓶中。

乳基质热处理温度程序如下：

参数	B-milk 9.5（煮沸乳）	A-milk 9.5（高压灭菌乳）
保温温度	99 °C ± 1 °C	115 °C ± 1 °C
保温时间	30 min ± 1 min	15 min ± 1 min
冷却	99 °C → 40 °C，< 40 min	115 °C → 40 °C，< 40 min
储存	< 7 °C，最少16小时，最多12天	< 7 °C，最少16小时，最多12天
酶活性	可能存在残留蛋白酶	完全灭活

质量保证：始终使用已知活性的对照发酵剂与测试样品平行运行，采用相同的时间、温度和水浴条件。通过校准温度探头在未接种对照瓶中测量的温度曲线必须在目标温度的±0.5 °C以内，该次运行方可被认可。

5. 精密度与实验室间验证

一项涉及5个国家10个实验室的国际协作研究（CpH环试）按照ISO 5725-1和ISO 5725-2进行，以确定CpH方法的精密度。测试了三种商业乳品发酵剂：

样品1：乳酸乳球菌菌株的中温O型发酵剂
样品2：乳酸乳球菌、肠膜明串珠菌和乳酸乳球菌乳脂双乙酰亚种菌株的中温LD型发酵剂
样品3：嗜热链球菌菌株的嗜温发酵剂

参数	样品1（r / R）	样品2（r / R）	样品3（r / R）
t_a（min）	7.3 / 21.1	7.8 / 12.0	4.0 / 6.5
pH_6h（样品1,2）/ pH_4h（样品3）	0.039 / 0.154	0.062 / 0.131	0.484 / 0.140
pH_16h	0.032 / 0.090	0.028 / 0.094	0.039 / 0.111

其中r为重复性限（实验室内），R为再现性限（实验室间）。数据表明，CpH方法实现了良好的精密度，特别是pH参数，大多数测量的再现性标准偏差低于0.06 pH单位。

工程洞察：t_a的再现性变异性（样品1的R = 21.1分钟）高于pH参数，这反映了延迟期对实验室间乳基质制备和温度平衡细微差异的固有敏感性。对于常规质量控制，pH_6h或pH_16h提供了更稳健的实验室间可比性。如果t_a对您的应用至关重要（例如快速发酵的嗜温发酵剂），则应在严格温度控制（±0.1 °C）和标准化乳粉采购方面加大投入。

6. 工程实施与最佳实践

6.1 水质要求

乳粉复溶用水必须满足细菌计数低于50个/ml且电导率低于5 µS/cm。氯化消毒水使用前必须中和。这些要求常被忽视，但对于消除酸化测量中的背景干扰至关重要。

6.2 电极管理

实施严格的电极轮换和维护计划：

每日更换校准缓冲液
每周更换储存用KCl溶液
每次发酵运行之间进行常规蛋白质/脂肪清洁
如怀疑噬菌体污染，在99 °C下进行30分钟热消毒

6.3 数据采集配置

如果数据记录器每15秒采集一次读数，则t_a参数（从pH_15min下降0.08 pH单位的时间）可以0.25分钟的分辨率确定。配置记录软件自动计算和报告t_a、pH_t和t_{pH x}参数，以减少手动数据处理误差。

6.4 温度控制

水浴温度必须控制在±0.2 °C以内。对于大规模测试计划，建议使用带外部温度传感器的循环水浴而非静态水浴，因为多个瓶子的热容量可能在插入时引起瞬时温度下降。

关键总结：ISO 26323:2009提供了一种经过国际验证的稳健方法，用于表征发酵剂的酸化活性。在电极维护、温度控制和乳基质质量得到充分重视的情况下，CpH方法能够为发酵乳制品的质量控制放行测试和研发优化提供所需的精密度。

7. 常见问题

问1：B-milk 9.5和A-milk 9.5有何区别？何时使用哪种？

B-milk 9.5通过煮沸制备（99 °C保持30分钟），可能保留残留酶活性，适用于多数常规发酵剂。A-milk 9.5通过高压灭菌（115 °C保持15分钟），完全灭活所有酶。当测试的发酵剂在B-milk 9.5中重复性不佳时（特别是怀疑残留蛋白酶活性干扰酸化测量时），应使用A-milk 9.5。

问2：如何处理酸化活性极慢或极快的发酵剂？

对于慢速发酵剂，将监测时间延长至16–24小时，重点关注pH_16h或t_{pH 4.50}参数。对于极快发酵剂（如浓缩嗜温发酵剂），降低接种百分比或增加第一步稀释倍数，使酸化曲线处于可测量范围内。

问3：测量过程中pH读数漂移是什么原因？

CpH测量中的pH漂移最常见的原因是：（a）pH电极隔膜被乳蛋白污染，（b）电极参比结中KCl溶液不足，或（c）水浴温度不稳定。每次运行前检查校准斜率（≥93%）和截距（−30至+30 mV），并在每次运行之间使用胃蛋白酶/HCl清洁液清洗电极至少15分钟。

问4：该方法能否用于非乳品发酵基质？

该标准专门针对干物质含量9.5%的乳基质进行了验证。但连续pH测量的原理可在适当验证后推广至其他基质。请注意，精密度数据（重复性和再现性限值）仅适用于实验室间研究中测试的指定乳基质和发酵剂类型。