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BS ISO 16649——食品与动物饲料微生物学β-葡萄糖醛酸酶阳性大肠杆菌计数标准系列
Microbiology of food and animal feeding stuffs — Horizontal method for the enumeration of β-glucuronidase-positive Escherichia coli
🦠 BS ISO 16649 是英国标准协会（BSI）以 ISO 16649 系列为基础制定的国家标准，针对食品与动物饲料微生物学中 β-葡萄糖醛酸酶阳性大肠杆菌（Escherichia coli）的计数提出统一的水平法（horizontal method）。大肠杆菌是食品卫生的重要指示菌，其存在提示可能存在粪便污染及致病菌风险，因此食品、饮料、乳制品、肉类与水产品等产品的微生物检验普遍要求对其进行计数。本系列规定了在44 ℃下、利用 β-葡萄糖醛酸酶（β-glucuronidase）活性进行选择性计数的两种技术：滤膜法与直接琼脂法。
💡 β-葡萄糖醛酸酶是多数大肠杆菌（尤其大肠杆菌属）具有的特征性酶，可水解底物 5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-葡萄糖苷（X-Glucuronide），产生蓝色菌落，从而实现直观、特异的计数。ISO 16649 系列将此原理标准化为国际通用的计数方法。
一、标准系列概述 📌
该系列由英国技术委员会 AW/9（微生物学） 负责制定并维护，在 ISO/TC 34（食品）框架内参与国际起草。系列标准以”水平法”定位，即适用于食品与动物饲料的通用方法，可与其他具体产品标准配合使用。标准采用”逐字采用”（verbatim）方式等同采用 ISO 国际标准。
水平法的核心思路是：样品匀液经适当稀释后，接种到含有 X-Glucuronide 底物的选择性培养基上，在 44 ℃ 下培养，β-葡萄糖醛酸酶阳性的大肠杆菌形成蓝色菌落，通过计数菌落并结合稀释倍数换算为每克（或每毫升）样品中的菌落形成单位（CFU/g 或 CFU/mL）。
⚠️ 需注意：ISO 16649 计数的是”β-葡萄糖醛酸酶阳性”的大肠杆菌，而非所有大肠菌群（coliforms）。某些大肠杆菌菌株可能缺乏 β-葡萄糖醛酸酶活性，因此该计数结果不能完全等同于总大肠杆菌数。
二、系列构成与分部 📋
BS ISO 16649 系列由两个分部构成，分别规定滤膜法与直接琼脂法两种计数技术。
| 标准分部 | 发布年份 | 主题 | 主要内容 |
|---|---|---|---|
| BS ISO 16649-1:2001 | 2001 | 44 ℃ 滤膜菌落计数法（使用滤膜与 X-Glucuronide） | 样品制备、滤膜过滤、培养基、44 ℃ 培养、蓝色菌落计数、结果计算与报告 |
| BS ISO 16649-2:2001 | 2001 | 44 ℃ 菌落计数法（使用 X-Glucuronide） | 样品匀液、表面涂布或倾注、选择性培养基、44 ℃ 培养、蓝色菌落计数、结果计算与报告 |
💡 滤膜法适用于可过滤的液体样品（如水、饮料），通过滤膜富集微生物、提高检出灵敏度；直接琼脂法适用于固体或半固体食品样品的匀液，操作更简便，是更通用的方法。
三、滤膜菌落计数法（第 1 部分）🔬
滤膜法将样品（或稀释液）通过孔径合适的微孔滤膜，微生物被截留在滤膜上，然后将滤膜贴放在含有 X-Glucuronide 的选择性培养基上进行 44 ℃ 培养。
3.1 样品制备与过滤
标准规定了样品的取样、稀释液制备、匀质化与稀释系列等步骤。将一定体积的样品匀液经微孔滤膜过滤，使微生物截留在滤膜表面，从而对低浓度样品起到富集作用。
3.2 培养与计数
将滤膜转移至选择性琼脂培养基上，在 44 ℃ 下培养一定时间。β-葡萄糖醛酸酶阳性大肠杆菌水解 X-Glucuronide 形成蓝色菌落，其他微生物受培养基抑制。计数蓝色菌落并结合稀释倍数与过滤体积计算 CFU 数。
⚠️ 滤膜法对滤膜孔径、过滤体积与样品浑浊度有要求：过度浑浊或含颗粒的样品可能堵塞滤膜，需适当稀释或改用直接琼脂法。
四、直接琼脂菌落计数法（第 2 部分）🧫
直接琼脂法将样品匀液接种到含有 X-Glucuronide 的选择性培养基表面（或倾注于培养基中），在 44 ℃ 下培养后计数蓝色菌落。
- 样品匀液：将样品与稀释液混合匀质，制备系列稀释液。
- 接种与培养：取适量稀释液涂布或倾注于选择性琼脂培养基，44 ℃ 培养。
- 菌落计数：计数 β-葡萄糖醛酸酶阳性（蓝色）菌落，选择菌落数在适宜计数范围（如 15～150 或 30～300）的平板。
- 结果计算与报告：按稀释倍数与接种体积计算每克/毫升样品的 CFU，必要时进行确认试验。
✅ 直接琼脂法无需滤膜，适用范围广，是食品与动物饲料样品大肠杆菌计数的通用方法，与滤膜法互为补充。
五、工程实践与应用 🛠️
- 🔍 抽样与样品处理：按无菌操作取样，避免交叉污染；固体样品需匀质化，液体样品可直接或稀释。
- 🔧 培养基与质量控制：使用符合标准要求的选择性培养基，用阳性/阴性对照菌株验证培养基性能，确保特异性与灵敏度。
- 📊 计数与结果：选择菌落数适中的平板计数，按公式换算并保留适当有效数字；对可疑菌落进行确认试验（如吲哚、甲基红等生化试验）。
- 📋 报告：按标准格式报告结果（如”<10 CFU/g"或具体数值），并注明检测方法与检出限。
六、常见问题解答 ❓
❓ 问：为什么要测 β-葡萄糖醛酸酶阳性大肠杆菌？
答：大肠杆菌是粪便污染与卫生质量的指示菌，β-葡萄糖醛酸酶阳性计数可特异、直观地评价食品卫生状况，且方法标准化、可比较。
答：大肠杆菌是粪便污染与卫生质量的指示菌，β-葡萄糖醛酸酶阳性计数可特异、直观地评价食品卫生状况，且方法标准化、可比较。
❓ 问：滤膜法与直接琼脂法有何区别？
答：滤膜法适合可过滤的液体样品，能富集低浓度微生物；直接琼脂法适合固体/半固体食品匀液，操作简便通用。二者均基于 β-葡萄糖醛酸酶产生蓝色菌落的原理。
答：滤膜法适合可过滤的液体样品，能富集低浓度微生物；直接琼脂法适合固体/半固体食品匀液，操作简便通用。二者均基于 β-葡萄糖醛酸酶产生蓝色菌落的原理。
❓ 问：为什么培养温度是 44 ℃？
答：44 ℃ 可抑制多数非肠道微生物，提高选择性，使 β-葡萄糖醛酸酶阳性大肠杆菌（如典型大肠杆菌）更易被特异计数。
答：44 ℃ 可抑制多数非肠道微生物，提高选择性，使 β-葡萄糖醛酸酶阳性大肠杆菌（如典型大肠杆菌）更易被特异计数。
❓ 问：结果如何表示？
答：以每克或每毫升样品中的菌落形成单位（CFU/g 或 CFU/mL）表示，低于检出限时报告”<检出限”。
答：以每克或每毫升样品中的菌落形成单位（CFU/g 或 CFU/mL）表示，低于检出限时报告”<检出限”。
❓ 问：该计数能否代表全部大肠杆菌？
答：不能完全代表。个别大肠杆菌菌株可能缺乏 β-葡萄糖醛酸酶活性而漏检，因此结果针对”β-葡萄糖醛酸酶阳性”亚群；必要时结合其他方法（如 ISO 7251）综合判断。
答：不能完全代表。个别大肠杆菌菌株可能缺乏 β-葡萄糖醛酸酶活性而漏检，因此结果针对”β-葡萄糖醛酸酶阳性”亚群；必要时结合其他方法（如 ISO 7251）综合判断。
