水中大肠埃希氏菌两步膜过滤分离与计数标准试验方法（D5392-24）

📋 概述与适用范围

标准Ｄ５３９２–２４由ＡＳＴＭ国际组织Ｄ１９委员会水质分委会负责制定，最初于１９９３年批准发布，最新修订于２０２４年，取代Ｄ５３９２–１９。该标准规定了两步膜过滤程序用于水中大肠埃希氏菌的分离与计数。大肠埃希氏菌是总大肠菌群中的一种，仅来源于温血动物粪便；其在水中检出即表明水体受到粪便污染，并可能存在肠道致病菌风险。

该标准已被成功验证适用于温带地区的淡水、海水以及废水等水体类型，用户如需用于其他类型水（如高浊度工业废水或极端ｐＨ环境）则必须自行完成方法的有效性确认。标准的检测下限为一个菌落形成单位每过滤样品，理论上只要水样中含有活菌即可获阳性。标准全文采用国际单位制，并引用多项ＡＳＴＭ配套标准（如Ｄ１１２９术语、Ｄ１１９３试剂水、Ｄ３３７０采样规程、Ｄ３８７０微生物性能特征建立以及Ｄ５４６５平板法计数指南），构成完整的方法学体系。

⚙️ 试验原理与方法

膜过滤法的核心是将已知体积的水样通过微孔滤膜，细菌被截留在膜表面。随后将滤膜转移至选择性培养基上，在４４.５°Ｃ条件下培养２４小时。大肠埃希氏菌特有的β–葡萄糖醛酸苷酶能将培养基中的显色底物分解，形成蓝色或蓝绿色菌落。两步法的设计体现在：第一步通过选择性培养基分离总大肠菌群（乳糖发酵产酸产气），第二步通过特异性生化试验（如靛酚氧化酶反应或吲哚生成）对疑似菌落进行确认，从而将大肠埃希氏菌与其他肠杆菌科细菌区分开，显著提高检测的特异性。

设备要求包括：可灭菌的过滤装置（含支架、漏斗、收集瓶）、亲水性滤膜（孔径０.４５微米）、真空泵、恒温培养箱、无菌培养皿与培养基。试样制备需根据水样预期菌密度选择直接过滤或稀释后过滤。典型步骤：取适量水样过滤，用无菌缓冲液冲洗滤膜，镊子夹取滤膜贴附于Ｍ–ＦＣ培养基或Ｃ–ＥＣ琼脂平板，倒置培养２２至２４小时。计数典型菌落后，挑选至少五个菌落进行证实试验（如靛酚氧化酶、吲哚、甲基红等），计算证实阳性率并换算最终结果。结果报告为菌落形成单位每１００毫升或每升。

📊 技术参数与指标

标准自身明确的核心技术参数包括检测限、统计置信水平以及适用范围。同时，标准引用Ｄ３８７０对微生物计数方法需考察的性能特征给出了统一定义，各实验室在应用本标准时应结合自身条件确定具体的偏倚、精密度及特异性数值。以下两表总结了标准的关键指标和性能特征要求。

🔬 工程应用与注意事项

在饮用水卫生监测中，该标准常被用于出厂水和管网末梢水的大肠埃希氏菌日常检测，结果快速（２４小时）且能精准定量。对于废水处理厂，可利用本方法评估消毒效果及尾水排放的微生物安全性。环境监测中，河流、湖泊及海滨浴场的水质评价也广泛采用本方法。应用时核心注意事项包括：１）过滤体积应根据水样浊度与预期菌密度适当调整，避免膜面菌落过度密集导致计数不准；２）使用前需确认滤膜的亲水性及完整性，灭菌过程不得损坏膜结构；３）每批试验应设置阳性对照（大肠埃希氏菌标准株）和阴性对照（无菌水），保证培养基与试剂的有效性。

质量控制要点还包括：严格遵循Ｄ３３７０进行采样，样品在采集后６小时内进行过滤；按照Ｄ５４６５的指南计数平板，避免漏计或重复；若菌落形态不典型，必须挑取纯化后做生化确认；结果报告应注明过滤体积和检测限。标准范围中明确要求用户对非推荐水质类型自行开展方法验证，不可直接套用。此外，标准第９节涉及安全警示，操作致病菌时应在生物安全柜中进行，遵守实验室生物安全管理规定。

❓ 常见问题解答