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PD CEN ISO TS 29843——土壤质量土壤微生物多样性测定技术规范系列（PLFA与PLEL分析方法）
Soil quality — Determination of soil microbial diversity — PLFA and PLEL analysis methods（技术规范系列解读）
🧫 PD CEN ISO TS 29843 是英国采用 CEN ISO/TS 29843 系列技术规范形成的公开文件（Published Document）系列，用于统一土壤微生物多样性的磷脂脂肪酸（PLFA）与磷脂醚脂（PLEL）分析方法。该系列由英国 BSI 技术委员会 EH/4（土壤质量）参与制定与转化，其下分为两个部分：第 1 部分规定采用 PLFA 与 PLEL 两种指标联合测定土壤微生物多样性；第 2 部分则规定采用简化 PLFA 提取方法的磷脂脂肪酸分析流程。由于技术规范仍处于试用阶段，UK 经验会定期反馈给国际组织，供其评估是否将其转化为正式国际标准。
💡 磷脂是活体微生物细胞膜的基本组分，细胞死亡后磷脂会迅速降解，因此 PLFA/PLEL 含量能够灵敏反映土壤中”当下存活”微生物群落的结构与生物量，是土壤生态学研究中被广泛认可的化学指纹方法。
一、系列构成与适用范围 📌
本系列现行部分均与对应的 ISO 技术规范文本一致：第 1 部分等同于 ISO/TS 29843-1:2010，第 2 部分等同于 ISO/TS 29843-2:2011（2012-02-01 修正版），两者均于 2014 年在英国出版，并取代已被撤销的 DD ISO/TS 29843-1:2010 与 DD ISO/TS 29843-2:2011。标准分类号（ICS）均为 13.080.30（土壤质量）。技术规范的有效期最初限定为三年，CEN 成员国在两年后提交意见，评估其能否转换为欧洲标准 EN，因此在过渡期内允许各国保留可能与之存在差异的国内标准并行使用。
- PD CEN ISO/TS 29843-1:2014——土壤质量 · 土壤微生物多样性测定 · 第 1 部分：磷脂脂肪酸分析（PLFA）与磷脂醚脂分析（PLEL）方法。该部分同时给出细菌、真菌等多类微生物的膜脂标记物提取、分离与量化流程，特别引入了醚脂类标记用于表征土壤古菌（Archaea）群落。
- PD CEN ISO/TS 29843-2:2014——土壤质量 · 土壤微生物多样性测定 · 第 2 部分：采用简化 PLFA 提取方法的磷脂脂肪酸分析方法。该部分对样品前处理与提取步骤进行简化，适合大批量样品筛查，并对公式（1）等关键计算给出了明确的符号定义与使用说明。
⚠️ 两款文件均属于”公开文件（PD）”性质，不构成英国国家标准，其地位是临时性的：使用者应在试验基础上应用，并将实际应用中发现的问题反馈给 BSI 相应技术委员会秘书处，以便国际组织在审查期内决策其最终状态。
二、方法原理：膜脂化学指纹 🔬
PLFA 分析的基本原理是：微生物细胞膜中的磷脂脂肪酸种类繁多，不同类群微生物具有独特的脂肪酸组成谱，例如直链饱和脂肪酸、支链脂肪酸（iso/anteiso）、环丙烷脂肪酸、单不饱和脂肪酸与多不饱和脂肪酸的相对比例可区分细菌、真菌与放线菌等类群。分析时先将土壤样品中的总脂质提取出来，再通过固相萃取（SPE）将脂质分离为中性脂、糖脂与极性磷脂三部分，随后进行甲基化衍生得到脂肪酸甲酯（FAME），最终用气相色谱（GC）配合氢火焰离子化检测器（FID）或质谱（MS）完成定性与定量。
PLEL 分析则针对古菌特有的磷脂醚脂结构，如二醚脂（diether）与四醚脂（tetraether），由于醚键对酸、碱及高温具有较强的耐受性，这类标记物能够在环境胁迫条件下稳定存在，从而为土壤微生物多样性评估补充了”细菌-真菌-古菌”三个维度的信息。两部文件对样品的采集、运输与保存提出了明确要求：为防止膜脂在存放期间水解或氧化，样品通常需冷冻干燥后低温避光保存，并在规定期限内完成分析。
⚠️ 样品保存是整个分析链中最容易出现偏差的环节。新鲜土壤采集后若不能在短期内处理，应尽快冷冻干燥；冻干样品也需在干燥、避光、低温条件下储存，否则脂肪酸会发生水解与氧化，导致谱图失真、群落结构被错误解读。
2.1 典型标记物与群落对应关系
| 标记脂肪酸（示例） | 主要来源类群 | 生态学含义 |
|---|---|---|
| i15:0、a15:0、i17:0 | 革兰氏阳性细菌等 | 细菌生物量组成部分 |
| 16:1ω7c、cy17:0、cy19:0 | 革兰氏阴性细菌 | 反映革兰氏阴性菌丰度与生理状态 |
| 18:2ω6,9c | 真菌 | 真菌生物量指标 |
| 10Me-16:0、10Me-18:0 | 放线菌 | 放线菌类群标记 |
| 二醚脂 / 四醚脂（PLEL） | 古菌 | 古菌群落丰度与多样性 |
💡 单一标记物对特定类群并非绝对专一，例如某些细菌也含有 18:2ω6,9c。因此在实际解读中通常综合多个标记物谱与比例因子（如真菌/细菌比、G+/G- 比）进行判断，避免”以单峰论类群”的误读。
三、分析流程与关键操作步骤 🧪
第 2 部分的简化 PLFA 方法将流程压缩为几个核心环节：土壤样品称量并冻干 → 采用氯仿-甲醇-缓冲液体系（类 Bligh-Dyer 法）进行单相提取 → 离心收集有机相 → 磷脂组分的 SPE 柱分离 → 温和碱性甲醇解得到 FAME → GC 分析。相比第 1 部分中的完整方案，简化法减少了液-液分配步骤的数量，提高了通量，同时在方法适用范围上给出了明确的适用土壤类型与基质限制，报告结果时需注明采用的提取方案与色谱条件。
- 提取体系：氯仿–甲醇–柠檬酸（或磷酸盐）缓冲液构成单相体系，确保极性磷脂从土壤颗粒与有机质中被充分溶出。
- 脂质分级：以硅胶键合相 SPE 柱依次用氯仿、丙酮与甲醇洗脱，分别获得中性脂、糖脂与磷脂馏分。
- 衍生化：磷脂馏分在碱性条件下进行甲醇解（如 KOH/甲醇），生成脂肪酸甲酯，必要时加入内标进行定量校正。
- 色谱测定：FAME 经 GC 分离，结合保留时间与质谱谱图鉴定碳链长度、双键位置与支链构型。
- 数据处理：以每克干土对应的 nmol 脂肪酸量表达各标记物丰度，进一步计算总磷脂脂肪酸量、多样性指数与群落结构矩阵。
✅ 规范的可操作性亮点在于给出了公式（1）等定量关系及完整的符号表，使不同实验室之间的结果具备可比性；同时明确了内标物的使用要求，这是保证批间、批内重复性的重要手段。
四、质量控制与结果报告 📊
为保证分析质量，系列文件要求实验室建立相应的质量控制程序：包括空白样品测定以评估试剂背景污染、平行样测定以估计随机误差、标准品的定期校准，以及图谱积分参数的统一设定。在结果报告中，应完整给出样品编号、取样深度、冻干与储存条件、提取方法（第 1 或第 2 部分方案）、色谱柱与升温程序、鉴定依据（保留时间或质谱）、检出限与回收率等元数据，以便同行评审与跨研究比较。
🚨 需要注意的是：PLFA 结果反映的是”相对”的群落指纹而非绝对的物种清单，它无法替代基于核酸的高通量测序。当研究问题涉及物种级分辨率或功能基因信息时，应选择分子生物学方法或与其联用，避免方法误用。
五、典型应用场景 🌍
- 农田与草地管理：评估耕作方式、施肥与轮作对土壤微生物群落的影响，指导土壤健康管理。
- 污染场地监测：通过群落结构变化追踪重金属、石油烃等污染物对微生物的胁迫效应。
- 生态恢复评价：比较不同恢复方案下土壤生物多样性的恢复程度，为工程决策提供依据。
- 气候与土地利用研究：量化不同土地利用类型下微生物生物量与群落组成差异，支撑碳氮循环模型校准。
六、常见问题解答 ❓
❓ 问：PD CEN ISO TS 29843 与正式国家标准有何区别？
答：PD 文件是以公开文件形式发布的临时性技术文件，不具有正式国际标准的地位，其目的是在试用期内积累应用经验以供审查。使用者应在其试验性基础上应用，并反馈问题。
答：PD 文件是以公开文件形式发布的临时性技术文件，不具有正式国际标准的地位，其目的是在试用期内积累应用经验以供审查。使用者应在其试验性基础上应用，并反馈问题。
❓ 问：第 1 部分与第 2 部分如何选择？
答：若研究同时需要 PLFA 与 PLEL 两类指标（尤其关注古菌群落），选择第 1 部分方案；若仅需 PLFA 生物量与大类群结构且样品量大、追求通量，可选择第 2 部分简化提取法。报告时应注明所采用的方案。
答：若研究同时需要 PLFA 与 PLEL 两类指标（尤其关注古菌群落），选择第 1 部分方案；若仅需 PLFA 生物量与大类群结构且样品量大、追求通量，可选择第 2 部分简化提取法。报告时应注明所采用的方案。
❓ 问：土壤样品最长可以保存多久再分析？
答：规范建议尽可能采集后立即冻干处理；冻干样品应低温避光保存并限期分析。长期保存会导致脂质氧化水解，建议在方案验证阶段即明确样品保存时限并写入报告。
答：规范建议尽可能采集后立即冻干处理；冻干样品应低温避光保存并限期分析。长期保存会导致脂质氧化水解，建议在方案验证阶段即明确样品保存时限并写入报告。
❓ 问：PLFA 分析能否直接鉴定微生物物种？
答：不能。PLFA 提供的是群落层面的化学指纹与生物量估计，分辨率一般到类群（细菌、真菌、放线菌、古菌）水平，物种级鉴定需借助核酸测序等方法。
答：不能。PLFA 提供的是群落层面的化学指纹与生物量估计，分辨率一般到类群（细菌、真菌、放线菌、古菌）水平，物种级鉴定需借助核酸测序等方法。
