Physical Address
304 North Cardinal St.
Dorchester Center, MA 02124
BS ISO 21528——食品和动物饲料微生物学肠杆菌科检测与计数标准系列
Microbiology of Food and Animal Feeding Stuffs — Horizontal Methods for the Detection and Enumeration of Enterobacteriaceae
🧫 BS ISO 21528 系列标准规定了食品和动物饲料中肠杆菌科（Enterobacteriaceae）细菌的检测与计数的水平方法。该系列由两部分组成：BS ISO 21528-1 规定了采用最大可能数（MPN）技术配合预增菌进行检测与计数的方法，BS ISO 21528-2 规定了菌落计数法。两篇标准共同替代了早期发布的 BS 5763-10:1993 与 BS 5763-15:1991，是食品微生物实验室执行卫生指标菌检验的重要依据，广泛应用于乳制品、肉制品、果蔬、饮用水及动物饲料等基质的微生物学评价。
💡 肠杆菌科是食品卫生学中一类重要的”指示菌”：其检出与数量高低可反映加工过程卫生控制水平、生鲜污染与二次污染风险。BS ISO 21528 为此提供了统一、可比对的水平检验方法。
一、系列构成与适用范围 📌
| 标准号 | 中文标题 | 主要方法 | 发布年份 |
|---|---|---|---|
| BS ISO 21528-1 | 食品和动物饲料微生物学——肠杆菌科检测与计数——第1部分：采用预增菌的MPN技术检测与计数 | MPN（最大可能数）技术 + 预增菌 | 2004 |
| BS ISO 21528-2 | 食品和动物饲料微生物学——肠杆菌科检测与计数——第2部分：菌落计数法 | 平板菌落计数法 | 2004 |
两个部分均采用”水平方法（horizontal method）”的定位，即不针对某一特定产品类别，而是适用于各类食品与动物饲料。标准由 ISO/TC 34/SC 9（食品微生物学）制定，英国方面由技术委员会 AW/9（微生物学）负责其国家实施，并以英国国家标准（BS）形式原样采用 ISO 21528 文本。
⚠️ 适用时应注意：BS ISO 21528 属于检测与计数方法标准，其本身不设定微生物限量。具体产品的限量要求（如商业无菌、特定致病菌控制）应由相应产品标准或法规另行规定。
二、术语与基本概念 🔬
标准首先明确了若干关键术语：肠杆菌科指一类革兰氏阴性、兼性厌氧、在特定培养基上生长并具有特征的杆菌；预增菌（pre-enrichment）指将试验样品先接种于非选择性液体培养基中，在适宜温度下培养一段时间，以利于受损或受抑细菌的复苏；MPN（Most Probable Number，最大可能数）则是基于统计学原理，通过一系列稀释管（通常为三管法或多管法）中阳性与阴性管数的组合，推算出样品中目标菌最可能的数量。
在 MPN 技术中，检测（detection）与计数（enumeration）在概念上有所不同：检测关注”是否检出”，结果以检出/未检出表示；计数则关注”数量多少”，结果以每克（或每毫升）样品中的菌数表示。标准对这两种目的分别给出了可操作的程序。
三、BS ISO 21528-1：MPN 技术与预增菌 🔍
3.1 方法原理
第1部分的方法是：将试验样品与初始悬浮液混合，经过非选择性预增菌培养后，转接至选择性液体培养基中进行增菌；随后按最适稀释度进行系列稀释，并接种于多管（如三管一组）培养基中培养；最后根据各稀释度出现阳性反应的管数，查阅 MPN 表，得出样品中肠杆菌科的最可能数量。该方法适用于目标菌数量可能较低、或细菌可能处于受损/亚致死状态的样品。
3.2 操作要点
- 样品处理：按 ISO 6887 系列制备初始悬浮液与稀释液，确保代表性取样与充分均质。
- 预增菌：非选择性培养基（如缓冲蛋白胨水）在适宜温度（通常 35~37 ℃）培养，使受损菌复苏。
- 选择性增菌与确证：转接至选择性培养基后，观察特征性反应，必要时进行生化确证试验（如氧化酶、葡萄糖发酵等）。
- 结果计算：根据阳性管数查 MPN 表，结果以”每克/毫升样品 MPN 值”报告。
💡 MPN 技术特别适合低水平污染样品的半定量检验；其统计置信区间较宽，通常报告为”最可能数”而非精确计数，报告中应注明所用管数与置信水平。
四、BS ISO 21528-2：菌落计数法 🧮
4.1 方法原理
第2部分采用常规的平板菌落计数法：将样品悬浮液进行系列稀释，取一定量（如 1 mL 或 0.1 mL）接种于选择性固体培养基表面（涂布法）或与培养基混合（倾注法），在适宜温度下培养后，统计特征性菌落数，并乘以稀释倍数，得出每克/毫升样品中的菌落形成单位（CFU）。
4.2 培养基与确证
标准推荐使用选择性培养基（如紫红胆盐葡萄糖琼脂 VRBGA 等）以抑制非目标菌、便于肠杆菌科特征菌落的识别。对典型菌落，可进一步进行确证试验（如氧化酶试验、糖发酵试验等），以排除假阳性。结果以”CFU/g 或 CFU/mL”报告，并注明计数范围。
⚠️ 当样品中目标菌与大量背景菌群共存时，菌落计数法可能因菌落重叠或背景干扰而低估计数。此时应选择适宜稀释度，使平板上菌落数落在标准推荐的可计数范围（通常 15~150 或 25~250 CFU/皿）内。
五、关键培养基与质量控制 🧪
标准对培养基、试剂和稀释液的制备与验收提出了要求，强调使用经过验证的培养基批次，并定期进行阳性与阴性对照，以监控培养基的选择性与灵敏度。实验室还应建立并执行质量保证程序，包括空白对照、重复性评价以及参与能力验证计划。
| 控制环节 | 典型做法 | 目的 |
|---|---|---|
| 培养基验收 | 接种质控菌株检查生长与特征 | 确保培养基性能符合要求 |
| 阳性对照 | 接种已知肠杆菌科菌株 | 验证方法灵敏度 |
| 阴性对照 | 接种非目标菌或无菌水 | 验证方法选择性、排除污染 |
| 重复性评价 | 对同一样品平行测定 | 评估实验室精密度 |
六、结果报告与解释 📋
结果报告应包含：样品标识、检测方法与标准号（BS ISO 21528-1 或 -2）、检测结果（检出/未检出，或 MPN 值/CFU 计数）、所用稀释度与确证情况，以及必要的检测依据。当结果为”未检出”时，应注明所用方法的检出限，以正确解释阴性结果。
✅ 采用统一的水平方法，可确保不同实验室、不同批次样品间的结果具有可比性，为食品安全风险评估、卫生监督与产品放行提供可靠依据。
七、常见问题解答 ❓
❓ 问：BS ISO 21528-1 与 BS ISO 21528-2 有什么区别？何时选用？
答：-1 采用 MPN 技术并配合预增菌，适合低水平污染或受损菌的检测与计数；-2 采用菌落计数法，适合可形成清晰特征菌落的常规计数。实验室应根据样品性质、污染水平和目的选用。
答：-1 采用 MPN 技术并配合预增菌，适合低水平污染或受损菌的检测与计数；-2 采用菌落计数法，适合可形成清晰特征菌落的常规计数。实验室应根据样品性质、污染水平和目的选用。
❓ 问：肠杆菌科与大肠菌群、大肠杆菌是什么关系？
答：肠杆菌科是一个包含多种属的科级分类，大肠菌群和大肠杆菌均属于肠杆菌科范畴。检测肠杆菌科范围更宽，可作为更全面的卫生指示。
答：肠杆菌科是一个包含多种属的科级分类，大肠菌群和大肠杆菌均属于肠杆菌科范畴。检测肠杆菌科范围更宽，可作为更全面的卫生指示。
❓ 问：MPN 法与平板计数法结果可以互换吗？
答：不能简单互换。MPN 给出的是统计估计值，菌落计数给出的是可直接计数的 CFU 值，两者在方法学上存在差异，报告时应注明所用方法。
答：不能简单互换。MPN 给出的是统计估计值，菌落计数给出的是可直接计数的 CFU 值，两者在方法学上存在差异，报告时应注明所用方法。
🔬 问：样品中细菌受损时为什么要预增菌？
答：加工、冷冻、酸性环境等可能使细菌处于受损或亚致死状态，直接接种选择性培养基会抑制其生长。预增菌在非选择性培养基中使受损菌复苏，从而提高检出率。
答：加工、冷冻、酸性环境等可能使细菌处于受损或亚致死状态，直接接种选择性培养基会抑制其生长。预增菌在非选择性培养基中使受损菌复苏，从而提高检出率。
